Anlage 35

NACHWEIS UND BESTIMMUNG VON HEXAMIDEN, DIBROMHEXAMIDIN, DIBROMPROPAMIDIN UND CHLORHEXIDIN

1. 1. Zweck und Anwendungsbereich

   Diese Methode beschreibt ein Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von

• Hexamidin und dessen Salzen einschließlich Isethionat und p-Hydroxybenzoat,
• Dibromhexamidin und dessen Salzen einschließlich Isethionat,
• Dibrompropamidin und dessen Salzen einschließlich Isethionat,
• Chlorhexidindiacetat, -digluconat und -dihydrochlorid

  in kosmetischen Erzeugnissen.

1. 2. Definition

   Der nach diesem Verfahren ermittelte Gehalt an Hexamidin, Dibromhexamidin, Dibrompropamidin und Chlorhexidin wird in Massenprozent (% m/m) des Erzeugnisses angegeben.

1. 3. Kurzbeschreibung

   Die qualitative und quantitative Bestimmung erfolgt mit Hilfe der Ionenpaar-HPLC mit reverser Phase und nachfolgender UV-Spektrophotometrie. Hexamidin, Dibromhexamidin, Dibrompropamidin und Chlorhexidin werden über ihre Retentionszeit nachgewiesen.

1. 4. Reagenzien

   Alle Reagenzien müssen analysenrein und, wo erforderlich, für die HPLC geeignet sein.

1. 4.1. Methanol.
2. 4.2. Natriumsalz der 1-Heptansulfonsäure, Monohydrat.
3. 4.3. Essigsäure (Eisessig, d₂₀ = 1,05 g/ml).
4. 4.4. Natriumchlorid.
5. 4.5. Fließmittel (Mobile Phase).
6. 4.5.1. Eluent I: 0,005 M Lösung des Natriumsalzes der 1-Heptansulfonsäure (4.2) in Methanol (4.1), mit Essigsäure (4.3) auf einen scheinbaren pH-Wert von 3,5 eingestellt.
7. 4.5.2. Eluent II: 0,005 M wäßrige Lösung des Natriumsalzes der 1-Heptansulfonsäure (4.2), mit Essigsäure (4.3) auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt.

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• Eluent I: 5,84 g Natriumchlorid (4.4) und 1,1013 g des Natriumsalzes der 1Heptansulfonsäure (4.2) werden in 100 ml Wasser gelöst. Nach Zusatz von 900 ml Methanol (4.1) wird die Mischung mit Essigsäure (4.3) auf einen scheinbaren pH-Wert von 3,5 eingestellt.
• Eluent II: 5,84 g Natriumchlorid (4.4) und 1,1013 g des Natriumsalzes der 1Heptansulfonsäure (4.2) werden in 1 Liter Wasser gelöst und mit Essigsäure (4.3) auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt.

1. 4.6. Hexamidindiisethionat [C₂₀H₂₆N₄O₂2C₂H₆O₄S].
2. 4.7. Dibromhexamidindiisethionat [C₂₀H₂₄Br₂N₄O₂2C₂H₆O₄S].
3. 4.8. Dibrompropamidindiisethionat [C₁₇H₁₈Br₂N₄O₂2C₂H₆O₄S].
4. 4.9. Chlorhexidindiacetat [C₂₂H₃₀Cl₂N₁₀2C₂H₄O₂].
5. 4.10. Referenzlösungen: 0,05%ige (m/v) Lösungen von jedem der vier Konservierungsmittel (4.6 bis 4.9) in Eluent I (4.5.1).
6. 4.11. 3,4,4'-Trichlor-carbanilid (Triclocarban).
7. 4.12. 4,4'-Dichlor-3-trifluormethyl-carbanilid (Halocarban).
8. 5. Geräte
9. 5.1. Normale Laborausstattung.
10. 5.2. Hochleistungsflüssigkeitschromatograph mit UV-Detektor mit variabler Wellenlänge.
11. 5.3. Analytische Trennsäule.

    Material: Edelstahl,

    Länge: 30 cm,

    Innendurchmesser: 4 mm,

    Aktiver Festkörper: -Bondapak C₁₈, 10 m, oder gleichwertiges Erzeugnis.

1. 5.4. Ultraschallbad.
2. 6. Nachweis
3. 6.1. Vorbereitung der Probe

   Ungefähr 0,5 g Probe werden in einen 10-ml-Meßkolben eingewogen und mit Eluent I (4.5.1) zur Marke aufgefüllt. Der Meßkolben wird 10 Minuten lang in ein Ultraschallbad (5.4) gestellt. Die Mischung wird anschließend zentrifugiert oder durch ein Faltenfilter filtriert. Die überstehende Flüssigkeit bzw. das Filtrat wird für den Nachweis verwendet.

1. 6.2. Chromatographie
2. 6.2.1. Gradientenprogramm:

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1. 6.2.2. Volumenstrom der mobilen Phase (6.2.1): 1,5 ml/min, Säulentemperatur: 35 °C.
2. 6.2.3. Detektionswellenlänge: 264 nm.
3. 6.2.4. 10 l jeder Referenzlösung (4.10) werden injiziert und die Chromatogramme aufgezeichnet.
4. 6.2.5. 10 l der Probelösung (6.1) werden injiziert und das Chromatogramm aufgezeichnet.
5. 6.3. Durch Vergleich der Retentionszeiten der nach 6.2.5 aufgezeichneten Peaks mit den nach 6.2.4 ermittelten Retentionszeiten wird das Vorhandensein von Hexamidin, Dibromhexamidin, Dibrompropamidin bzw. Chlorhexidin nachgewiesen.
6. 7. Bestimmung
7. 7.1. Herstellung der Standardlösungen

   Als innerer Standard wird eines der Konservierungsmittel (4.6 bis 4.9), das in der Probe nicht vorhanden ist, verwendet. Ist dies nicht möglich, kann Triclocarban (4.11) oder Halocarban (4.12) verwendet werden.

1. 7.1.1. 0,05%ige (m/v) Stammlösung des nach 6.3 identifizierten Konservierungsmittels in Eluent I (4.5.1).
2. 7.1.2. 0,05%ige (m/v) Stammlösung des als inneren Standard gewählten Konservierungsmittels in Eluent I (4.5.1).
3. 7.1.3. Gemäß nachstehender Tabelle werden für jedes identifizierte Konservierungsmittel vier Standardlösungen hergestellt, indem die entsprechenden Volumina der Stammlösung des identifizierten Konservierungsmittels (7.1.1) und der Stammlösung des inneren Standards (7.1.2) in eine Serie von 10-ml-Meßkolben pipettiert und mit Eluent I (4.5.1) bis zur Marke aufgefüllt und gemischt werden.

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1. 7.2. Vorbereitung der Probe
2. 7.2.1. Ungefähr 0,5 g der Probe (p Gramm) werden in einen 10-ml-Meßkolben genau eingewogen, mit 1,0 ml der Lösung des inneren Standards (7.1.2) und 6 ml Eluent I (4.5.1) versetzt und gemischt.
3. 7.2.2. Die Mischung wird 10 Minuten in ein Ultraschallbad (5.4) gestellt und nach dem Abkühlen mit dem Eluenten I (4.5.1) zur Marke aufgefüllt und gemischt. Die Mischung wird anschließend zentrifugiert oder durch ein Faltenfilter filtriert. Die überstehende Flüssigkeit bzw. das Filtrat wird chromatographiert.
4. 7.3. Chromatographie
5. 7.3.1. Der Gradient und der Volumenstrom der mobilen Phase, die Säulentemperatur und die Detektionswellenlänge werden entsprechend den Bedingungen für den Nachweis (6.2.1 bis 6.2.3) eingestellt.
6. 7.3.2. 10 l der Probelösung (7.2.2) werden chromatographiert, die Peakflächen gemessen und das Verhältnis zwischen der Peakfläche des zu bestimmenden Konservierungsmittels und der Peakfläche des inneren Standards ermittelt. Die Wiederholbarkeit des Meßsignals wird durch wiederholtes Chromatographieren überprüft.
7. 7.4. Eichung
8. 7.4.1. 10 l jeder der vier Standardlösungen (7.1.3) werden chromatographiert und die Peakflächen gemessen.
9. 7.4.2. Für jede Standardlösung (7.1.3) wird das Verhältnis zwischen der Peakfläche des Hexamidins, des Dibromhexamidins, des Dibrompropamidins bzw. des Chlorhexidins und der Peakfläche des inneren Standards ermittelt.

   Es wird eine Eichkurve gezeichnet, indem die Peakflächenverhältnisse als Ordinate und die entsprechenden Konzentrationen des zu bestimmenden Konservierungsmittels in der Standardlösung in Mikrogramm je Milliliter als Abszisse aufgetragen werden.

1. 7.4.3. Aus der Eichkurve (7.4.2) wird die Konzentration des zu bestimmenden Konservierungsmittels abgelesen, die dem nach 7.3.2 ermittelten Peakflächenverhältnis entspricht.
2. 8. Berechnung

   Der Gehalt an Hexamidin, Dibromhexamidin, Dibrompropamidin oder Chlorhexidin in Massenprozent (% m/m) der Probe wird nach folgender Formel berechnet:

​

1. 9. Wiederholbarkeit (¹)

   Bei einem Gehalt an Hexamidin, Dibromhexamidin, Dibrompropamidin oder Chlorhexidin von 0,1% (m/m) dürfen die Ergebnisse zweier an derselben Probe parallel durchgeführter Bestimmungen um nicht mehr als 0,005% (m/m) voneinander abweichen.

1. 10. Molmassen

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__________

(1) ISO 5725.

Zuletzt aktualisiert am

09.05.2017

Gesetzesnummer

10010899

Dokumentnummer

NOR12138679

alte Dokumentnummer

N8199547986J

Zusatzdokumente: image001, image002, image003, image004, image005, image006